O-糖基化作為常見的翻譯後修飾，參與着各種重要的生(shēng)命活動。與N-糖修飾相比，O-糖具有豐度低、核心結構複雜(zá)且多樣等特點，由于缺乏恒定修飾序列（可随機修飾在絲氨酸、蘇氨酸和羟賴氨酸上）以及缺乏特異性切O-糖工(gōng)具酶，蛋白(bái)O-糖的鑒定一(yī)直被視為行業難題。
CD24（Cluster of Differentiation 24）是一(yī)種高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇錨定表面蛋白(bái)，高表達于多種惡性腫瘤表面，利用其高度糖基化的結構與腫瘤相關巨噬細胞上的抑制性受體(tǐ)Siglec-10（唾液酸結合免疫球蛋白(bái)型凝集素）相互作用，發出“don't eat me”信号，促進免疫逃逸。
CD24Fc是一(yī)種重組人CD24胞外(wài)域和人免疫球蛋白(bái)IgG1 Fc端的融合蛋白(bái)。既可以阻斷CD24與Siglec-10相互作用，來增強巨噬細胞對表達CD24的腫瘤細胞吞噬作用，又(yòu)可以增強體(tǐ)内半衰期，同時Fc融合蛋白(bái)形式的二聚體(tǐ)也增強了藥物(wù)穩定性。但由于CD24存在高度密集的N-/O-糖基化修飾位點，複雜(zá)的糖型（圖1），使得CD24Fc藥物(wù)研發中(zhōng)糖分(fēn)析異乎尋常地困難。
近日，漢騰生(shēng)物(wù)歐洲子公司FyoniBio的Robert Wilmanowski博士等人的研究成果《Precise O‑Glycosylation Site Localization of CD24Fc by LC-MS Workflows》刊登在Analytical Chemistry雜(zá)志(zhì)，首次利用多種酶切策略結合LC-MS的CID裂解和EThcD裂解技術互補分(fēn)析，在糖肽層面，精确定位了CD24Fc蛋白(bái)中(zhōng)所有O-糖修飾位點和糖型分(fēn)布，對CD24Fc融合蛋白(bái)的藥物(wù)開(kāi)發有着重要意義，同時也為緻力于O-糖組成，O-糖位點分(fēn)析的研究者們提供了新的方法。
二、分(fēn)析流程
為降低目标蛋白(bái)複雜(zá)度，研究者采用IdeS酶切結合ProA純化，在亞基層面富集到CD24蛋白(bái)後采用PNGaseF和Trypsin酶切。如圖2（左）所示，得到去(qù)除N-糖含完整CD24序列的結構域組分(fēn)，利用LC-MS技術，針對包含1-32位氨基酸的糖肽片段進行分(fēn)析，獲得CD24（CD24部分(fēn)僅含31個氨基酸）上所有O-糖單元組成及相對含量。（見圖3，x_y_z分(fēn)别代表NeuAc(x)_Hex(y)_HexNAc(z) 糖單元的個數）。
由于OpeRATOR酶具備特異性酶切O-糖基化後的S/T的N端肽鍵的特性（聯合SialEXO唾液酸切除酶可提高效率）。首先使用Asp-N将CD24序列切成3段，然後利用SialEXO和OpeRATOR酶切特性，繼續縮短糖肽長度，且再次酶切所得的肽段N端氨基酸即為O-糖基化位點。如圖2（右）所示，實驗結果表明，CD24主要O-糖位點為T25和T15，而T4，T5，T7，S12，S28存在少量的O糖修飾。
此外(wài)，研究者還采用OpeRATOR/SialEXO酶結合PNGaseF和Lys-C酶切，獲得含不同氨基酸的糖肽，結合LC-MS/MS（EThcD模式）對O-糖位點精細研究鑒定，可得T25，T15為主要O-糖修飾位點，T4, T5，S12，S14，S16，S18，T28存在少量O糖修飾，而T3，T7，T11存在微量的O-糖修飾。
三、鑒定結果
綜合兩種分(fēn)析流程（LC-MS CID和EThcD裂解技術），結合多種酶（IdeS, Asp-N, PNGaseF, OpeRATOR, SialEXO, Trypsin, Lys-C），确定了CD24Fc融合蛋白(bái)的O-糖基化位點和O-糖基化相對修飾程度，如圖5所示，結果顯示CD24Fc蛋白(bái)共包含12個O-糖基化位點，其中(zhōng) 7個O-糖基化位點在兩種分(fēn)析流程均得到驗證，另有5個O-糖基化位點可以被ETHcD裂解分(fēn)析流程驗證，如圖5（下(xià)）。
該研究首次精确确證了CD24 O-糖基化位點和相對修飾程度，填補了CD24蛋白(bái)O-糖基化修飾的空白(bái)領域，拓寬了LC-MS在糖肽水平O-糖基化研究策略，同時也為CD24信号療法的藥物(wù)研發提供堅實可靠的理論結構依據。
關于FyoniBio GmbH
FyoniBio GmbH是漢騰生(shēng)物(wù)全資(zī)歐洲子公司，專注于生(shēng)物(wù)大(dà)分(fēn)子藥物(wù)開(kāi)發及分(fēn)析服務 ，核心團隊成員(yuán)具備20年以上的生(shēng)物(wù)制藥開(kāi)發經驗。公司可為全球生(shēng)物(wù)制藥客戶提供細胞系開(kāi)發、上下(xià)遊工(gōng)藝開(kāi)發、分(fēn)析方法開(kāi)發及臨床生(shēng)物(wù)檢測等專業服務。目前已為多家跨國藥企及生(shēng)物(wù)技術公司提供高品質的生(shēng)物(wù)藥開(kāi)發及分(fēn)析服務。
網址：www.fyonibio.com
漢騰生(shēng)物(wù)擁有全流程全方位的生(shēng)物(wù)藥大(dà)分(fēn)子分(fēn)析檢測平台，完善的質量保證體(tǐ)系，完全依從相關法規，保證操作合規性及數據的完整性，可支持産品表征研究、了解分(fēn)子的關鍵質量屬性，制定可靠的質量控制策略等。我(wǒ)(wǒ)們時刻關注最新的法規政策，不斷升級技術配備，以便更快、更好、更全地為客戶提供一(yī)站式的分(fēn)析解決方案。涵蓋單抗、雙抗、重組/融合蛋白(bái)、蛋白(bái)疫苗、mRNA疫苗、AAV 載體(tǐ)、質粒、重組/合成多肽、核酸藥物(wù)、ADCs等分(fēn)析研究。
參考文獻：Precise O‑Glycosylation Site Localization of CD24Fc by LC-MS Workflows
文獻鍊接：https://www.nstl.gov.cn/paper_detail.html?id=0258b1488e32fa235e35cca357eeec60